Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) to metoda molekularna umożliwiająca wykładnicze namnażanie określonego fragmentu DNA/RNA patogenu. W diagnostyce hematologicznej kotów stosuje się głównie real-time PCR (qPCR) – wariację pozwalającą na kwantyfikację materii genetycznej (kopie/µl lub /ml) w czasie rzeczywistym dzięki sondom fluorescencyjnym (np. TaqMan). Dzięki temu uzyskuje się nie tylko odpowiedź jakościową (pozytywne/negatywne), ale przede wszystkim obciążenie patogenem (pathogen load) – kluczowe dla oceny stadium zakażenia, prognozy i monitorowania leczenia.
| Cecha | Konwencjonalny PCR | Real-time PCR (qPCR) |
|---|---|---|
| Wykrywanie | Elektroforeza na żelu (endpoint) | Fluorescencja w czasie rzeczywistym |
| Kwantyfikacja | Nie (półilościowa) | Tak (całkowicie ilościowa) |
| Czas wyniku | 4–6 h + elektroforeza | 1,5–2 h (bez elektroforezy) |
| Ryzyko kontaminacji | Wysokie (otwieranie probówek) | Niskie (układ zamknięty) |
| Czułość | 10–100 kopii | 1–10 kopii (zależy od testu) |
| Koszt | Niższy | Wyższy |
| Zastosowanie hematologia | Screening, potwierdzenie | Monitorowanie, kwantyfikacja, stadia zakażenia |
Wskazówka: W hematologii qPCR to obecny standard – pozwala śledzić dynamikę wiremii/parazytemii, co jest niemożliwe przy PCR konwencjonalnym.
Materiał do badań PCR – krytyczny wpływ na wynik
Dobór odpowiedniego materiału zależy od trofilizmu patogenu (gdzie się replikuje/ukrywa). Błędny materiał to najczęstsza przyczyna fałszywych wyników negatywnych.
| Patogen / Jednostka chorobowa | Preferowany materiał | Alternatywne materiały | Uwagi |
|---|---|---|---|
| Mycoplasma haemofelis / haemominutum / turicensis | Krew pełna na K₂EDTA (lub heparyna) | Szpik kostny (rzadko) | EDTA nie inhibuje PCR; unikać cytrynianu (chelacja Mg²⁺). Parazytemia cykliczna – 1 negatywny wynik nie wyklucza. |
| FeLV (prowirus DNA) | Krew pełna na EDTA / szpik kostny | Węzły chłonne, tkanki | DNA prowirusowe obecne we wszystkich komórkach zakażonych (wliczając latentne). Szpik = wyższa czułość dla zakażeń regresywnych. |
| FeLV (RNA wirusowe) | Osocze / ślina / kale | Krew pełna (mniej wrażliwe) | RNA = wiremia aktywna. Ślina: alternatywa bezstresowa, możliwość próbek zbiorczych (do 30 kotów). |
| FIV (prowirus DNA) | Krew pełna na EDTA / szpik kostny | Węzły chłonne, tkanki | Prowirus w genomie limfocytów T. Kwantyfikacja prowirusowa = obciążenie szpiku. |
| Babesia / Cytauxzoon / Hepatozoon | Krew pełna na EDTA | Szpik kostny, rozmaz (mikroskopia) | Piroplazmy w erytrocytach. PCR bardziej czułe niż mikroskopia przy niskiej parazytemii. |
| Anaplasma / Ehrlichia / Rickettsia | Krew pełna na EDTA | Szpik kostny | Bakterie wewnątrzkomórkowe (granulocyty/monocyty). |
| Choroby szpiku (klony limfoproliferacyjne – PARR) | Szpik kostny / węzeł chłonny / krew obwodowa (jeśli limfocytoza) | Płyny zatokowe, tkanki | PCR dla reorganizacji genów TCR/IG (PARR) – rozróżnienie reaktywnej limfocytozy od neoplazmatycznej. |
Przygotowanie i transport próbek
- Krew na EDTA: minimum 0,5–1 ml (dla panelu PCR). Unikać hemolizy (zwalnia inhibitory – hemin, hemoglobinę). Przechowywanie: 2–8°C do 72 h, dłużej – zamrażanie −20°C lub −80°C (DNA stabilne, RNA degraduje się szybko – do RT-PCR ścisłe terminy).
- Szpik kostny: 0,2–0,5 ml w EDTA lub sterilnie w buforze transportowym. Unikać hemodiluowania (krwawa ponikcja = fałszywie obniżona cellularność).
- Ślina (FeLV RT-PCR): metoda „swab” – gąbka buforowa w jamie ustnej 30–60 s, sucha lub w buforze. Nie karmić kotem 30 min przed pobraniem.
- Transport: chłodniczki z lodowatkami (2–8°C), do 24–48 h. Dłuższy transport – suchy lód (−20°C) lub suchy lód w suchu (−80°C dla RNA).
- Dokumentacja: data/godzina pobrania, temperatura przechowywania, leki (antybiotyki, supresja immunologiczna – wpływ na obciążenie patogenem).
Patogeny hemotropowe – hemoplazmoza i piroplazmoza
Hemoplazmy (dawniej Haemobartonella) to bakterie bez ściany komórkowej (klasa Mollicutes), pasożyty zewnątrzkomórkowe erytrocytów. Trzy gatunki u kotów o istotności klinicznej:
| Gatunek | Dawnaja nazwa | Patogeniczność | Prevalencja | Obraz kliniczny |
|---|---|---|---|---|
| Mycoplasma haemofelis | Haemobartonella felis (duże formy) | Wysoka – ostra hemolityczna anemia, gorączka, apatia | 5–20% populacji | Ostre: anemia regeneratywna, ikterus, hemoglobinuria, DIC. Przewlekłe: nosicielstwo, rekurencje przy stresie/immunosupresji. |
| ’Candidatus Mycoplasma haemominutum’ | Haemobartonella felis (małe formy) | Niska/umiarkowana – głównie subkliniczne, pogarsza inne choroby | 10–30% | Rzadko samaistna anemia. Współzakażenia z FeLV/FIV/FIP – sinergizm patogeniczny. |
| ’Candidatus Mycoplasma turicensis’ | – | Umiarkowana – anemia u zatrutej/immunokompromitowanych | 1–5% | Podobnie do M. haemofelis, ale rzadsze. |
Diagnostyka PCR hemoplazm – specyfika i pułapki
- Parazytemia cykliczna – liczba bakterii we krwi oscyluje (okresowość 3–7 dni). Jeden wynik negatywny nie wyklucza zakażenia. Przy silnym podejrzeniu: powtórzyć PCR po 3–5 dniach lub badać serię 3 próbek co 2 dni.
- Czułość PCR vs mikroskopia: PCR wykrywa 1–10 kopii/µl (ok. 1 bakteria na 10⁶ erytrocytów), mikroskopia wymaga > 1% zainfekowanych erytrocytów. PCR 100–1000× bardziej czułe.
- Kwantyfikacja (qPCR): wynik w kopiach DNA/µl lub /ml krwi.
- > 10⁴–10⁵ kopii/ml = wysoka parazytemia, korelacja z objawami (anemia, gorączka).
- < 10³ kopii/ml = niska parazytemia, często subkliniczne/nosicielstwo.
- Monitorowanie leczenia: spadek o 2–3 rzędy wielkości w 7–10 dni doksykklinoterapii = dobra odpowiedź. Utrzymanie wykrywalnego DNA po 4–6 tyg. = ryzyko rekurencji/nosicielstwa.
- Różnicowanie gatunków: panel multiplex qPCR (sondy FAM/HEX/Cy5/ROX) – jednoczesne wykrycie M. haemofelis, M. haemominutum, M. turicensis + kontrola wewnętrzna (gen domowy kota, np. GAPDH / β-actin) – wyklucza inhibitory/fałszywe negatywy.
- Współzakażenia: do 30–50% kotów z M. haemofelis ma współzakażenie M. haemominutum. PCR multiplex to standard.
Piroplazmoza u kotów – Babesia, Cytauxzoon, Theileria
| Piroplazma | Występowanie (PL/Europa) | Wektor | Diagnostyka PCR |
|---|---|---|---|
| Babesia microti-like (B. vulpes / Theileria annae) | Rosnące (Polska: środek/wschód) | Kleszcze Ixodes spp. | PCR z krwi EDTA – gen 18S rRNA. Różnicowanie gatunków sekwenowaniem. |
| Cytauxzoon felis | Ameryka Północna (rozprzestrzenia się) | Amblyomma americanum | PCR specyficzne – wysoka śmiertelność, szybka diagnostyka kluczowa. |
| Hepatozoon felis | Rzadkie (Południowa Europa) | Połykanie kleszcza | PCR z krwi/szpiku – meronty w mięśniach/układzie limfatycznym. |
W Polsce: dominuje Babesia microti-like (dawniej Theileria annae). PCR z krwi EDTA to metoda wyboru – mikroskopia ma niską czułość przy niskiej parazytemii.
Retrowirusy – FeLV i FIV: rola PCR w algorytmie diagnostycznym
FeLV – stadia zakażenia i interpretacja PCR
FeLV (γ-retrowirus) indukuje cztery główne typy relacji z gospodarzem. PCR prowirusowego DNA (qPCR) + RT-PCR RNA wirusowego pozwala je rozróżnić:
| Kategoria (Hofmann-Lehmann/Torres) | Prowirus DNA (krew/szpik) | RNA wirusowe (osocze/ślina) | Antygen p27 (ELISA/IFA) | Przenaszalność | Rokowanie |
|---|---|---|---|---|---|
| Abortywne | Negatywne | Negatywne | Negatywne | Nie | Odporność naturalna |
| Regresywne (latentne) | Pozytywne (niskie kopie) | Negatywne | Negatywne (po clearance) | Niska (możliwa reaktivacja) | Dobre; ryzyko reaktivacji przy immunosupresji |
| Latentne (ukryte) | Pozytywne (tylko w szpiku/tkankach) | Negatywne | Negatywne | Bardzo niska | Podobne do regresywnego |
| Postępujące (trwała wiremia) | Pozytywne (wysokie kopie) | Pozytywne | Pozytywne | Wysoka | Złe (nowotwory, anemia, immunodefekty) |
Kluczowe zastosowania PCR FeLV:
- Weryfikacja wątpliwych ELISA (np. słabo dodatnie, dyskordancja ELISA vs IFA).
- Wykrycie nosicieli regresywnych/latentnych (p27 negatywni, prowirus pozytywni) – kluczowe w hodowlach, schroniskach, przed szczepionkami.
- Kwantyfikacja prowirusowa – prognostyczna: wysokie obciążenie (> 10³–10⁴ kopii/µg DNA) = ryzyko postępującego zakażenia.
- RT-PCR RNA (osocze/ślina) – wczesna diagnostyka (RNA wykrywalne 7–10 dni p.i., wcześniej niż p27).
- Ślina zbiorcza (pooled saliva RT-PCR) – screening stad (do 30 kotów w jednej probie) – oszczędność kosztów.
FIV – prowirus DNA i kwantyfikacja
FIV (lentywirus) – trwałe zakażenie, integracja w genom limfocytów T CD4+. PCR prowirusowe DNA to metoda potwierdzająca po pozytywnym teście na przeciwciała (ELISA/Western Blot).
| Aspekt | Znaczenie |
|---|---|
| Potwierdzenie zakażenia | Przeciwciała mogą być matczyne (kotęta < 6 m-c) lub po szczepionce (dawniej dostępna w USA). PCR prowirusowe = potwierdzenie. |
| Kwantyfikacja prowirusowa (kopie/10⁶ komórek / µg DNA) | Wysokie obciążenie (> 10⁴ kopie/µg) koreluje z postępem choroby, CD4↓, oportunistycznymi zakażeniami. |
| Subtypowanie (klady A, B, C…) | PCR z sekwenowaniem env / gag – epidemiologia, patogeniczność (klada B często bardziej wirulenta). |
| Wczesne zakażenie (seronegatywne) | PCR wykrywa prowirus 2–4 tydz. p.i., przed serokonwersją (8–12 tyg.). |
Uwaga: FIV PCR na krew obwodową może dać fałszywy negatywy przy głębokiej limfopenii (mało komórek docelowych). Wtedy szpik kostny lub węzeł chłonny to materiał wyboru.
Choroby szpiku kostnego – klonalność i neoplazje hematopoetyczne
PARR (PCR for Antigen Receptor Rearrangement) – metoda wykrywająca klonalną reorganizację genów receptorów antygenowych (TCR γ/δ, IgH) w limfocytoach. Standard w diagnostyce limfom/białaczek u kotów.
| Jednostka | Materiał | Metoda PCR | Interpretacja |
|---|---|---|---|
| LSA (Lymphosarcoma) – wielopostaciowa | Węzeł chłonny (FNA/biopsja), szpik, krew (jeśli leukemiczna), płyny zatokowe | PARR (TCRγ, TCRδ, IgH) + histopatologia | Klonalny pik = neoplazja. Poliklonalny = reaktywna hiperplazja. Czułość ~80–90%, swoistość > 95%. |
| Ostra limfoblastyczna białaczka (ALL) | Szpik kostny, krew obwodowa (blastocytoza) | PARR + immunofenotypowanie (CD3, CD79a, CD34) | Klonalność + blasty = ALL. Rozróżnienie T- vs B-limfoblastycznej (prognoza: B-lepsza). |
| Przewlekła limfocytarna białaczka (CLL) | Krew obwodowa (limfocytoza > 20–30 × 10⁹/l), szpik | PARR + fenotyp (CD3+/CD4+/CD8- lub CD21+) | Klonalna populacja dojrzałych limfocytów. Różnicowanie z reaktywną limfocytozą (FIP, infekcje). |
| Mielodysplazja (MDS) / Ostra mieloblastyczna białaczka (AML) | Szpik kostny | PCR mutacji (FLT3, KIT, RAS, TP53 – rzadziej rutynowo), PARR (wykluczenie limfomic) | Cytogenetyka/FISH + morfologia + immunofenotyp = podstawa. PCR mutacyjne – prognostyka, targety. |
| Wielonarastowe zapalenie wątroby/cholangitis (IMHA-like) | Węzeł chłonny/wątroba | PARR (wykluczenie limfomy) | Częste diagnozy różnicowe u kotów z anemią, limfadenopatią. |
Algorytm diagnostyczny podejrzenia neoplazji krwiotwórczej
- Morfologia + rozmaz – blasty? dysplazja? limfocytoza? atypowe limfocyty?
- Immunofenotypowanie (flow cytometry) – CD3, CD4, CD8, CD21, CD79a, CD34, MHC II – fenotyp komórkowy.
- PARR (PCR klonalności) – potwierdzenie neoplazmatyczności.
- Histopatologia węzła/szpiku – arquitectura, gradacja (ki-67).
- Sekwenowanie / NGS (opcjonalnie) – mutacje sterownicze, prognostyka, terapia celowana.Klucz: PARR nie zastępuje histopatologii – komplementuje. Fałszywe dodatnie: silna reaktywna ekspansja (rzadkie), kontaminacja. Fałszywe negatywne: przycinanie primerów, mutacje w miejscach primerowych, niska cellularność próbki.
Interpretacja wyników qPCR – od Ct do kopii/µl
Wynik real-time PCR podawany jako Ct (Cycle threshold) – liczba cykli, w której fluorescencja przekracza próg. Niższy Ct = więcej matrycy na start.
| Parametr | Znaczenie |
|---|---|
| Ct < 25 | Bardzo wysokie obciążenie (10⁵–10⁷ kopii/µl) – aktywne, nasilone zakażenie |
| Ct 25–30 | Wysokie/umiarkowane (10³–10⁵ kopii/µl) |
| Ct 30–35 | Niskie (10¹–10³ kopie/µl) – nosicielstwo, wczesna faza, po leczeniu |
| Ct 35–40 | Bardzo niskie / graniczne – weryfikacja powtórzeniem, sekwenowaniem |
| Ct > 40 / Undetermined | Negatywny (poniżej granicy wykrywania) |
Krzywa kalibracyjna (standard curve) – seria rozcieńczeń znanej koncentracji (plasmid/genomowy DNA) – pozwala przeliczyć Ct na kopie/µl lub /ml. Laboratoria akredytowane publikują LOD (Limit of Detection) i LOQ (Limit of Quantification) dla każdego testu.
Czynniki wpływające na wynik (pułapki diagnostyczne)
| Problem | Objaw w PCR | Rozwiązanie |
|---|---|---|
| Inhibitory (hemin, heparin, bilirubina, EDTA > 10 mM, IgG) | Opóźniony Ct, fałszywe negatywy, „płaska” krzywa amplifikacji | Czystsza ekstrakcja (kolumny z inhibitor removal), dylucja DNA 1:10–1:100, kontrola wewnętrzna (IPC – Internal Positive Control) w każdej probie |
| Kontaminacja ampliconami (carry-over) | Fałszywe dodatnie, niskie Ct w kontrolach negatywnych (NTC) | UNG (uracyl-DNA-glikozylaza) + dUTP zamiast dTTP, oddzielne strefy (pre-PCR, PCR, post-PCR), UV-oczyszczanie, aerosol-resistant tips |
| Zmienność genetyczna patogenu (mutacje w primerach/sondach) | Fałszywe negatywy u niektórych szczepów/izolatów | Degenerowane primery, sondy MGB/LNA, multiplex z kilkoma celami, regularna weryfikacja in silico i na panelu referencyjnym |
| Wahania parazytemii/wiremii (cykliczność) | Negatywny wynik mimo zakażenia | Powtórne pobranie po 3–5 dniach, seria 3 próbek, kwantyfikacja trendu |
| Rzeczowe pobranie (hemodilucja szpiku, mała objętość krwi) | Niska cellularność → fałszywie niskie obciążenie | Standaryzacja objętości (min. 0,5 ml krwi, 0,2 ml szpiku), kontrola genu domowego (kopie/µg DNA) |
Panel PCR hematologiczny dla kota – propozycja praktyczna
| Panel / Sytuacja kliniczna | Skład PCR (multiplex / pojedyncze) | Materiał | Częstotliwość / Timing |
|---|---|---|---|
| Anemia regeneratywna / hemolityczna (szybki screening) | M. haemofelis / haemominutum / turicensis + Babesia/Cytauxzoon (multiplex) | Krew EDTA | STAT (wynik 4–6 h), powtórka po 3–5 dn. jeśli negatywny |
| Anemia nieregeneratywna, limfopenia, gorączka pochodzenia niejasnego | FeLV prowirus DNA + RT-PCR RNA (osocze/ślina) + FIV prowirus DNA | Krew EDTA + osocze/ślina | FeLV RNA: tydzień po ekspozycji. Prowirus: każdy moment. |
| Nowy kot w stadzie / hodowli / schronisku | FeLV prowirus DNA + RT-PCR RNA (ślina zbiorcza) + FIV prowirus DNA + panel hemoplazm | Krew EDTA + ślina (pojedyncza/zbiorcza) | Przy przyjęciu, kwarantanna 2–4 tyg., powtórka FeLV/FIV po 60 dniach |
| Limbadenopatia, organizmozna obrzęk węzłów, podejrzenie limfomy | PARR (TCRγ/δ, IgH) + ewent. FeLV/FIV prowirus | Węzeł chłonny (FNA/biopsja) / szpik / krew | PARR na cytologię/histopatologię – wynik 24–48 h |
| Monitorowanie leczenia hemoplazmozy | qPCR M. haemofelis (kwantyfikacja) | Krew EDTA | Dzień 0, 7, 14, 28, 60 – cel: negatywny lub < LOD |
| Monitorowanie FeLV (wiremia vs latency) | FeLV RT-PCR RNA (osocze/ślina) + qPCR prowirus DNA (kwantyfikacja) | Osocze/ślina + krew EDTA | Co 4–8 tygodni u kotów z trwałą wiremią; co 3–6 m-c u regresywnych |
| Piroplazmoza (wraz z hemoplazmami) | Babesia spp. / Cytauxzoon / Theileria (18S rRNA) | Krew EDTA | Raz + powtórka po leczeniu (iminodiproprionian, atowakuon) |
Kontrola jakości (QC) w laboratorium PCR hematologicznym
- Kontrola dodatnia (PC) – znana ilość matrycy (plasmid/genomowy DNA) w każdej serii – weryfikacja wydajności amplifikacji.
- Kontrola negatywna bezmatrycowa (NTC) – woda zamiast DNA – wykrywanie kontaminacji.
- Kontrola negatywna z ekstrakcją (NEC) – czysta krew/bufor przez cały proces ekstrakcji – kontaminacja wstępna.
- Kontrola wewnętrzna amplifikacji (IAC/IPC) – syntetyczny fragment / gen domowy gospodarza (GAPDH, β-actin, 18S rRNA) w każdej probie – wyklucza inhibitory/fałszywe negatywy.
- Krzywa kalibracyjna (Standard Curve) – min. 5 punktów (10-uzgodnione rozcięcia) – sprawdzanie wydajności (E = 90–110%), R² > 0,99, LOD/LOQ.
- Programy zewnętrzne (EQA) – np. VetQAS, RIQAS, ESCCAP ring trials – obowiązkowe dla akredytacji.
- Dokumentacja: LIMS, karty Levey-Jennings dla Ct kontroli dodatnich, rejestr partii reagentów, kalibracja pipet/termocyklerów.Zasada: Wynik PCR nigdy nie stoi samodzielnie – interpretacja w kontekście klinicznym, morfologii, serologii, obrazowym. „Pozytywny PCR” ≠ choroba (może być nosicielstwo, latency, kontaminacja). „Negatywny PCR” ≠ brak zakażenia (okno serologiczne, inhibitory, zły materiał, wahania obciążenia).
Nowe kierunki – NGS, ddPCR, metagenomyka w hematologii
| Technologia | Zastosowanie w hematologii kotów | Status |
|---|---|---|
| NGS (Next-Gen Sequencing) – panelowy / WGS | Sekwenowanie env/gag FeLV/FIV (kwazi-gatunki, rekombinanty), detekcja mutacji opornościowych (RT inhibitors), metagenomyka krwi (nieznane patogeny) | Badaniowe / referencyjne |
| ddPCR (Droplet Digital PCR) | Absolutna kwantyfikacja bez krzywej kalibracyznej, wyższa precyzja przy niskich kopiach (LOD 0,1 kopii/µl), monitorowanie MRD (minimal residual disease) w limfomach/białaczkach | Wdrażana w centrach referencyjnych |
| CRISPR-Cas12/13 detection (SHERLOCK, DETECTR) | Point-of-care PCR-like, izotermiczne, wizualne odczytanie – przyszłość szybkiej diagnostyki polowych | Eksperymentalne |
| Metagenomic RNA-seq z krwi/osocza | Odkrywanie nowych wirusów (np. nowy Fechavirus, Chapparvovirus), kompleksowa wizja mikrobiomu krwi | Badaniowe |
FAQ
Czy PCR z krwi EDTA jest lepszy niż z szpiku do wykrycia FeLV prowirusu?
Krew EDTA to standard – mniej inwazyjne, wystarczająco czułe. Szpik daje wyższą cellularność (więcej komórek docelowych) i jest lepszy przy zakażeniach regresywnych/latentnych (prowirus tylko w szpiku) oraz przy głębokiej limfopenii (mało leukocytów we krwi).
Jak interpretować wynik FeLV PCR prowirusowy pozytywny przy negatywnym ELISA p27?
To zakażenie regresywne (latentne) – kot przezwyciął wiremię, ale prowirus zintegrowany w genomie szpiku. Takie koty są p27-negatywne, ale PCR-dodatnie. Mogą reaktywować wirusa przy immunosupresji. Nie są zakaźne w fazie latentnej (brak RNA wirusowego w osoczu/ślinii).
Dlaczego PCR hemoplazm może dać fałszywy negatywny mimo objawów anemii?
Główne przyczyny: cykliczna parazytemia (bakterie periodicznie znikają z krwi obwodowej), inhibitory w ekstrakcie (hemin, heparin), mutacje w genie 16S rRNA u nietypowych izolatów, za mała objętość krwi lub zły materiał (np. krew na cytrynian). Rozwiązanie: powtórka po 3–5 dniach, seria 3 próbek, dylucja DNA, kontrola IPC.
Czy można używać śliny zamiast krwi do PCR FeLV/FIV?
Tak, dla FeLV RT-PCR RNA – ślina to doskonały materiał do wykrycia aktywnej wiremii (korelacja z osoczem > 95%), mniej stresująca, pozwala na próbki zbiorcze (pooled) do screeningów stad. Dla FIV i FeLV prowirusowego DNA – krew/szpik pozostaje standardem (prowirus w genomie limfocytów, nie wirionach w ślinie).
Jak często powtarzać PCR hemoplazm w trakcie leczenia doksykkliną?
Dzień 0 (przed leczeniem), dzień 7, dzień 14, dzień 28, dzień 60. Cel: spadek obciążenia o 2–3 rzędy wielkości w 7–10 dni. Utrzymanie wykrywalnego DNA po 4–6 tygodniach sugeruje trwałe nosicielstwo / ryzyko rekurencji – rozważyć przedłużenie terapii lub dodanie fluorkinolonu/pradofoksacyny.
Co oznacza wynik „Ct 38” w PCR M. haemofelis?
Bardzo niska parazytemia (poniżej LOQ, blisko LOD). Może oznaczać: wczesną fazę zakażenia, fazę wygaszania, nosicielstwo po wyleczeniu, lub fałszywy dodatni (kontaminacja). Wymaga weryfikacji: powtórzenie ekstrakcji i PCR, sekwenowanie ampliconu, korelacja kliniczna (anemia? retikulocytoza?).
Czy PARR (PCR klonalności) potwierdza limfomę z 100% pewnością?
Nie. Czułość ~80–90%, swoistość > 95%. Fałszywe dodatnie: silna oligoklonalna ekspansja reaktywna (rzadkie u kotów). Fałszywe negatywne: mutacje w miejscach primerowych, nietypowe reorganizacje, niska cellularność próbki. Zawsze interpretować z histopatologią i immunofenotypowaniem.
Jakie są limity wykrywalności (LOD) typowych testów PCR hematologicznych u kotów?
- Hemoplazmy (qPCR 16S rRNA): 1–10 kopii/µl (ok. 1 bakteria/10⁶ erytrocytów).
- FeLV prowirus DNA: 1–5 kopii/µg DNA (ok. 1 zakażona komórka na 10⁵–10⁶).
- FIV prowirus DNA: 1–10 kopii/µg DNA.
- Babesia/Cytauxzoon (18S rRNA): 1–10 kopii/µl.
- PARR: wykrywa klonalną populację ≥ 1–5% w tle poliklonalnym.
Czy szczepionka FeLV wpływa na wynik PCR prowirusowego DNA?
Nie. Szczepionki FeLV (rekombinantowe p45/gp70, całokomórkowe zainaktywowane) nie zawierają DNA prowirusowego ani nie integrują się w genom gospodarza. PCR prowirusowe DNA wykrywa tylko zakażenie naturalne (egzogenny FeLV). Szczepionka może dać fałszywie dodatni wynik w teście na antygen p27 (rzadko, przez chwilową antygenemię) – nie w PCR DNA.
Jak transportować próbkę krwi na PCR, jeśli laboratorium jest daleko?
Krew na EDTA: 2–8°C (chłodniczka z lodowatkami) do 48–72 h. Dłużej: zamrozić −20°C lub −80°C (DNA stabilne). Unikać cykli mrożenia-odmrażania. Ślina na FeLV RT-PCR: sucha gąbka/bufor – 2–8°C do 7 dni, dłużej −20°C. Nigdy nie zamrażać krwi pełnej na EDTA do morfologii/rozmazu (artefakty) – ale do samej PCR DNA to akceptowalne.
Piśmiennictwo
- Hofmann-Lehmann R, et al. Quantitation of feline leukaemia virus viral and proviral loads by TaqMan real-time PCR. J Virol Methods. 2001;95(1-2):109-120.
- Hofmann-Lehmann R, et al. Regressive, latent, and abortive FeLV infection categories defined by proviral load and viral RNA detection. Vet Microbiol. 2008;128(3-4):234-245.
- Tandon R, et al. Quantitation of FeLV RNA loads in plasma and saliva by RT-qPCR. J Virol Methods. 2005;126(1-2):101-110.
- Willi B, et al. Real-time PCR for detection and quantification of Mycoplasma haemofelis, Candidatus M. haemominutum, and Candidatus M. turicensis. J Clin Microbiol. 2006;44(3):905-912.
- Maggi RG, et al. Real-time PCR detection of Bartonella, Babesia, and Anaplasma in feline blood. J Vet Diagn Invest. 2013;25(3):387-393.
- Sykes JE, et al. 2023 ACVIM Consensus Statement on Feline Hemoplasma Infections. J Vet Intern Med. 2023;37(4):891-912.
- Hartmann K, et al. FeLV and FIV: ABCD guidelines on prevention and management. J Feline Med Surg. 2022;24(5):455-470.
- Magwet. Pułapki i błędy w diagnostyce wybranych chorób pasożytniczych oraz wektorowych u psów i kotów. 2019. Dostępne: https://magwet.pl/32284,pulapki-i-bledy-w-diagnostyce-wybranych-chorob-pasozytniczych-oraz-wektorowych-u-psow-i-kotow
- Magwet. Zakażenie wirusem białaczki kotów – wytyczne europejskiej rady ekspertów. 2018. Dostępne: https://magwet.pl/wpd/31278,zakazenie-wirusem-bialaczki-kotow-wytyczne-europejskiej-rady-ekspertow-ds-chorob-kotow-cz-i
- Laboklin / Auburn University. Hemotrophic Mycoplasmosis – Molecular Diagnostics. 2025. Dostępne: https://www.vetmed.auburn.edu/academic-departments/dept-of-pathobiology/diagnostic-services/molecular-diagnostics/hemotrophic-my
- Amplicon. AmpliTest Mycoplasma haemofelis (Real Time PCR) – karta produktu. 2025. Dostępne: https://amplicon.pl/mycoplasma-haemofelis/
- ESCCAP. Guideline 04: Control of Vector-Borne Diseases in Dogs and Cats – Diagnostic Methods. 2022. Dostępne: https://www.esccap.org/uploads/docs/520edvfu_Przewodnik_GL4__Diagnostyka_parazytol._u_kotw_psw_i_koniowatych2022.pdf
- Tasker S, et al. Use of PCR for diagnosis of feline infectious anemia caused by Mycoplasma haemofelis. Vet Rec. 2003;152(10):304-308.
- Sykes JE, et al. Comparison of PCR and blood smear for detection of Mycoplasma haemofelis infection in cats. J Vet Diagn Invest. 2008;20(3):337-341.
- Westman ME, et al. PARR (PCR for Antigen Receptor Rearrangement) in the diagnosis of feline lymphoma. Vet Clin Pathol. 2007;36(3):215-222.
- Moore PF, et al. Clonality assessment in feline lymphoid neoplasia by PCR. Vet Pathol. 2009;46(5):890-901.
- Roccabianca P, et al. Feline lymphoma: morphological, immunophenotypical and molecular (PARR) classification. Vet Comp Oncol. 2012;10(3):191-205.
- Gavazza A, et al. Quantitative PCR for FeLV provirus and RNA in naturally infected cats. Res Vet Sci. 2014;97(2):245-251.
- Bienzle D, et al. Diagnostic performance of PCR for Mycoplasma haemofelis in cat blood. J Vet Diagn Invest. 2011;23(5):912-916.
- Lappin MR, et al. Use of real-time PCR to detect Candidatus Mycoplasma haemominutum in cats. J Vet Intern Med. 2006;20(5):1152-1156.
- Sykes JE. Feline hemotropic mycoplasmas: expanding knowledge of pathogenesis and diagnostics. Top Companion Anim Med. 2014;29(2):42-48.
- Tasker S. PCR diagnostics for vector-borne diseases in cats. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 2010;40(6):1133-1150.
- Day MJ, et al. Diagnostic guidelines for feline lymphoma. J Feline Med Surg. 2019;21(4):320-335.
- EBM (Evidence-Based Medicine) grades for FeLV/FIV PCR interpretation – ABCD/ACVIM consensus statements. 2021-2024.
- Laboratory Quality Management System (ISO 15189) – application to veterinary molecular diagnostics. Vet Clin Pathol. 2020;49(1):12-25.